CRISPR-система внесла до епігену спадкоємні зміни

Біологи розробили систему CRISPRoff, яка здатна спрямовано придушувати активність генів, не вносячи мутацій в ДНК. Механізм роботи цього інструменту заснований на епігенетичному перепрограмуванні, яке не залежить від CpG-сайтів метилювання в генах. Придушення активності генів CRISPRoff спадкується, що вдалося показати на поколіннях стовбурових клітин, що розвиваються в нейрони. Вчені також створили інструмент, здатний відновити активність генів після CRISPRoff і назвали його CRISPRon.

Від редактора

Спочатку замітка називалася «» CRISPR-інструмент відредагував геном без розривів ДНК «», проте до цього вже існували системи, засновані на «» мертвому «» Cas9 (dead Cas9) і здатні вносити зміну в епігеном. Але в таких роботах, на відміну від обговорюваної в замітці, не перевірялося успадкування змін в поколіннях клітин, що діляться, що і відображає виправлений заголовок.

Система спрямованого геномного редагування CRISPR/Cas9 - один з найбільш затребуваних інструментів у біологічних дослідженнях. Така система дозволяє вносити розриви в певне місце в геномі за допомогою білка Cas9 в комплексі з направляючою РНК, що найчастіше використовують у двох цілях: «вимкнення» розірваного гена або вбудова нової послідовності в розрив. Отримання моделей з непрацюючими генами дозволяє досліджувати їх функції і змінювати властивості організмів залежно від завдань вчених. За відкриття механізмів роботи системи CRISPR/Cas у 2020 році присудили Нобелівську премію дослідницям Еммануель Шарпантьє і Дженніфер Дудні.

Незважаючи на універсальність цього методу, його застосування обмежене необхідністю вносити розриви в послідовність ДНК, що часто призводить до мутацій в нецільових районах геному і неправильного відновлення ДНК в цільових. Так, наприклад, скандально відомий Хе Цзянкуй, який вперше отримав генно-модифікованих дітей (а надалі і тюремний термін), не зміг контролювати точність роботи CRISPR у своїх експериментах - в геномах близнюків виявилися нецільові мутації.

Біологи з університету Каліфорнії створили CRISPR-механізм, який здатний «вимикати» гени без внесення розривів і мутацій в ДНК. Він заснований на епігенетичному перепрограмуванні - метилуванні нуклеотидів (приєднанні до них метильної групи) таким чином, щоб ген втратив спорідненість до ферментів транскрипції і перестав працювати. Свою розробку біологи назвали CRISPRoff.

Як і в класичному CRISPR-інструменті, одним з компонентів у ньому став білок Cas9, але не звичайний, а «мертвий» (deadCas) - тобто здатний тільки зв'язуватися з потрібною ділянкою ДНК, але не вносити в неї розрив. До нього приєднали інші каталітичні домени - метилтрансферрази. Таким чином, хімерний білок зміг метилувати нуклеотиди ДНК навколо себе, пригнічуючи активність генів. При цьому вже через 10 днів після додавання білка до клітин, його вже було неможливо виявити, хоча його ефект зберігався до 15 місяців дослідження. Специфічність і ефективність роботи системи підтвердило секвенування РНК - у супресированих генів практично не було транскіптів. Ефект CRISPRoff спостерігався і для генів, в яких не були анотовані CpG-острівці - двонуклеотидні сайти в ДНК, за якими відбувається природне метилювання в клітині, тобто потенційно його можна використовувати для будь-якої послідовності в геномі.

Біологи також підтвердили, що метилювання CRISPRoff можна скасувати. Для цього вони створили схожий інструмент - CRISPRon. Цей білок також складався з інактивованого Cas і ферменту, але цього разу ним був деметилуючий агент. Щоб перевірити його роботу, біологи використовували клітини, в яких вже був метильований ген Вже через десять днів після застосування CRISPRon, в клітинах відновився нормальний рівень роботи гена (p < 0,0001).

Щоб перевірити, як ефект CRISPRoff зберігається при диференціюванні індукованих стовбурових клітин (ІСК) в інші клітинні типи, біологи обробили їх білком, після чого перепрограмували в нейрони. Це один з найпоширеніших методів отримання нервових клітин для досліджень, а збереження метиліювання в процесі диференціювання - важлива властивість для використання інструменту. Виявилося, нейрони дійсно зберегли мітки на обраних вченими генах.

На основі технології CRISPR/Cas створюють і інші системи. Так, наприклад, нещодавно ефективність методу збільшили за допомогою фотоіндукції, а також створили інструмент, який здатний редагувати кілька генів одночасно і вирізати з них ділянки.