Опосуми-альбіноси стали першими генетично відредагованими сумчастими

Біологи вперше відредагували геном сумчастого ссавця. Ним виявився будинковий опоссум, популярна лабораторна тварина. Скориставшись інструментом CRISPR/Cas9, дослідники відключили в зіготах цих звірків ген і отримали дитинчат-альбіносів. Як зазначається в статті для журналу, щоб досягти успіху, вченим довелося придумати, як змусити опосумів спарюватися в потрібний час і як проникнути крізь щільну оболонку їхніх яйцеклітин.

Будинкові опосуми () можуть здатися абсолютно непримітними створіннями: вони дрібні, скромно пофарбовані і нагадують мишей. Однак біологи високо цінують цих південноамериканських сумчастих як лабораторних тварин. Вся справа в особливостях їх розмноження: після чотирнадцяти днів вагітності самка будинкового опосума народжує дитинчат, які знаходяться на стадії, що відповідає тринадцяти-п'ятнадцятиденним ембріонам мишей і щурів або сорокаденним ембріонам людини. При цьому всі наступні дні юні опосуми ростуть поза тілом матері, прикріпившись до її сосків, і навіть не ховаються в сумці, яка у представників даного виду відсутня, так що відстежувати їх розвиток дуже зручно. Не дивно, що багато досліджень онтогенезу проводяться саме на будинкових опосумах. Крім того, ці сумчасті допомагають вивчати будову сечостатевої системи, інактивацію X-хромосоми і геномний імпрінтинг.

У 2007 році будинковий опоссум став першим сумчастим, геном якого секвенували. Однак відредагувати геном даного виду, як, втім, і будь-яких інших сумчастих, досі не вдавалося нікому. Це сильно обмежувало використання опоссумів в експериментах, оскільки у біологів не було можливості включати або вимикати роботу окремих генів цих тварин для вивчення їх функцій.

Виправити становище вирішила команда фахівців на чолі з Хіросі Кієнарі (Hiroshi Kiyonari) з Інституту фізико-хімічних досліджень (RIKEN). Перша проблема, яку вони повинні були вирішити, полягала в тому, щоб синхронізувати паркан зіот у одних самок опоссумів з підготовкою псевдоберемінних самок-реципієнтів, яким належало виношувати ембріони. Зробити це виявилося непросто, оскільки овуляція у даного виду не циклічна, а викликається зовнішніми стимулами, в першу чергу запахом самця. При цьому пара опоссумів залишається в місці протягом кілька тижнів, час від часу спарюючись. Така репродуктивна система погано підходить для налагодженого забору зигот.

Дослідники продемонстрували, що якщо ввести самкам гонадотропін сироватки жеребих кобил, вони спарюються в основному на третю ніч після зустрічі з самцем, в той час як без обробки це відбувається на четверту-сьому ніч. А якщо доповнити цю процедуру ін'єкцією хоріонічного гонадотропіну людини, вікно спарювання скоротиться ще сильніше: 70 відсотків самок будуть сукупуватися на четверту ніч. Втім, обробка гормонами не підвищила вироблення зигот порівняно з контрольною групою, а занадто великі дози і додаткова обробка людським гонадотропіном навіть зменшили їх виробництво, в деяких випадках - до нуля. У подальшій роботі автори використовували зіготи, отримані як від самок, оброблених гормонами, так і від самок з контрольної групи.

Будинкові опосуми спарюються в нічний час, а запліднена яйцеклітина досягає матки за 24 години, тому Кієнарі і його колеги припустили, що паркан зигот краще всього виробляти на другий ранок після спарювання, тобто через 30-34 години після сукупу. Однак піддослідні опосуми починали спарюватися відразу після вимикання світла в 21:00, тож зіготи, зібрані під час перших спроб, виявилися старшими за 34 годин і погано підходили для генного редагування: вони вкрилися оболонкою, характерною для зіот опоссумів і занадто твердою для стандартних мікроін'єкцій, а їхні пронуклеуси стали невидимими. Лише зрушивши час вимикання світла і, відповідно, початок спарювання на північ, дослідники змогли отримати більш свіжі зіготи, що краще підходять для подальших маніпуляцій (хоча і вони були покриті щільною оболонкою).

Потім дослідники приступили до підготовки псевдоберемінних самок-реципієнтів, необхідних для виношування зигот. Зазвичай для цього самкам дозволяють спаритися з самцями, які пройшли вазектомію, проте на сумчастих цю методику раніше не випробували. Кієнарі і його колеги змогли експериментальним шляхом довести, що даний підхід ефективний щодо опоссумів: після сукупів з вазектомованими самцями самки, як оброблені гормонами, так і немає, демонстрували ознаки помилкової вагітності, включаючи набухання матки. А після того, як в матку псевдоберемінної самки, яка не отримувала ін'єкцій гормонів, ввели зіготи іншої особини, вона успішно виносила і народила сімох дитинчат (дві самки, які отримували ін'єкції гормонів, не змогли виносити потомство).

Закінчивши з попередньою підготовкою, Кієнарі зі співавторами приступили до етапу генного редагування. Їх метою було впровадити інструмент CRISPR/Cas9 в зіготу на пронуклеарній стадії і з його допомогою вирізати з ДНК ген, що кодує фермент тирозиназу. Даний ген часто служить мішенню при тестуванні генетичних технологій, оскільки його відсутність призводить до альбінізму. Іншими словами, за зовнішнім виглядом дитинчат, які з'явилися на світ, легко зрозуміти, чи спрацювало редагування. Біля опоссумів розташований на четвертій хромосомі і складається з п'яти екзонів. Дослідники створили дві гідові РНК, яка націлює генетичні ножиці на четвертий з цих екзонів - його ж раніше вирізали, щоб відключити виробництво тирозинази у мишей.

Дослідники зібрали біля запліднених самок зиготи віком 34 години, за допомогою мікроін'єкційних голок з п'єзоелектричним приводом проникли крізь їх оболонку і ввели в пронуклеуси або цитоплазму інструмент генного редагування. Потім зіготи підсадили псевдоберемінним самкам, які не проходили обробку гормонами. Використання однієї гідової РНК не дозволило відключити ген, однак, коли її доповнили другою, експеримент призвів до потрібних результатів. З дев'ятнадцяти народжених дитинчат у п'ятнадцяти були відзначені ознаки недостатнього вироблення тирозинази. З них п'ять були альбіносами, двоє відрізнялися мозаїчним забарвленням, а вісім володіли нормальним забарвленням, але несли відредаговані алелі гена. Коли вчені схрестили самця-альбіноса з мозаїчною самицею, всі дев'ять їх дитинчат виявилися білими, тобто відредаговані алелі передалися наступному поколінню. Це вказує, що перше в світі редагування геному сумчастих пройшло успішно. Кієнарі і його співавтори сподіваються, що їх досягнення допоможе активніше використовувати будинкових опоссумів в якості лабораторних тварин, а також підстьобне дослідження сумчастих ссавців.

Близько двох років тому біологи вперше відредагували геном рептилій. Ними стали коричневі аноліси (), яких за допомогою CRISPR/Cas9 перетворили на альбіносів. Зміни були внесені не в запліднені, а в незрілі неоплодовані яйцеклітини.