Серологічні методи дослідження в діагностиці паразитарних захворювань

Серологічний аналіз крові - це спосіб лабораторного дослідження певних антигенів або антитіл (специфічних білків) у сироватці крові пацієнта, заснований на імунних реакціях організму. Цей метод застосовується при діагностиці інфекційних захворювань для виявлення наявності антитіл у крові хворого до певного виду вірусів або бактерій, а також для визначення групової приналежності крові.

Досліджуваний матеріал

У першу чергу для проведення серологічного аналізу використовують біологічний матеріал, зібраний від пацієнта:

• сироватка крові
• слина
• фекальні маси

У деяких випадках досліджується матеріал, виділений з певних об'єктів навколишнього середовища:

• вода
• ґрунт

Методика проведення аналізу або забору крові

Даний аналіз не вимагає спеціальної підготовки пацієнта. Забір крові проводиться вранці натощак і, проводиться в процедурних кабінетах лікувальних установ, відповідно до загальноприйнятих гематологічних методик. Для серологічного дослідження забір крові проводиться двома методами: венозну кров забирають з ліктьової вени пацієнта, а капілярну кров - з безіменного пальця. Кров поміщають у стерильні герметичні пробірки.

Особливості транспортування крові та зберігання сироватки Відразу ж після забору крові її транспортують до спеціальної лабораторії, де того ж дня проводиться підготовка сироватки. Зберігання сироватки допускається не більше 4 - 6 днів у холодильній камері при температурі 2 - 4 градусів. При необхідності більш тривалого зберігання, сироватка заморожується. Щоб уникнути порушення якості сироватки, допускається одноразове її заморожування і, відповідно, розморожування. При тривалому зберіганні антитіла втрачають свої властивості і стають частково неактивними, найбільш чутливими до заморожування є імуноглобуліни класу М. Після розморожування сироватки необхідно ретельне перемішування її до однорідної маси, що сприяє відновленню концентрації антитіл, що містяться в даній сироватці.

Для чого використовують серологічні дослідження?

Серологічні методи лабораторної діагностики використовуються для виявлення таких захворювань як ехінококкоз, трихінельоз, токсокароз, опісторгосп, цистицеркоз, токсоплазмоз, амебіаз, лямбліоз, для визначення ефективності проведеного курсу лікування і, нарешті, для виявлення повторного захворювання після повного одужання пацієнта.

Основні методи серологічної діагностики

Реакція імунофлюоресценції (РИФ)

Дана реакція є непрямим варіантом серологічного дослідження, тобто, виробляється вона в два етапи. На першому етапі проводять виявлення необхідного антитіла в циркулюючому комплексі антиген - антитіло за допомогою антиглобуліну, схожого за своєю структурою з білками імунної сироватки. Виявлення шуканого антитіла можливе також при вивченні заздалегідь приготованого антигенного препарату під люмінесцентним мікроскопом, без використання антиглобулінів. Імунофлюоресцентна реакція - дуже трудомісткий процес, що вимагає від фахівця чимало часу і відповідальності. Починається реакція з підготовки розчинів, потім сироватки та їх контрольні зразки піддаються титруванню (процес, що дозволяє визначити вміст певної речовини шляхом поступового змішування досліджуваного розчину з контрольованою кількістю реагента). Підготовлені раніше розведення і їх контрольні зразки акуратно наносяться на предметні скла з антигеном. Потім препарати піддаються інкубації, потім слідує їх відмивання і висушування на повітрі. На скло з антигеном тонким шаром наноситься антисироватка, після цього проводиться вторинна інкубація препаратів і, весь попередній ланцюг дій повторюється, завершуючись висушуванням препарату. В результаті препарат на предметному склі піддається обробці гліцерином і досліджується в люмінесцентному мікроскопі. Результати проведеної реакції оцінюються за чотирибальною шкалою, яка характеризується інтенсивністю поверхневого жовто-зеленого світіння клітин антигенів: + дуже слабке світіння клітини, помітне тільки на її периферії++ слабке світіння периферії клітини, але з явно помітним зеленим відтінком++ + + + + + яскраве світіння зеленого кольору периферії клітини

Титром реакції вважається таке розведення сироватки, де не менше 50% клітин антигену виявляють чітке поверхневе світіння, тобто результат реакції++ + або++ + + + +. Значення тиру реакції від 1/80 до 1/100.

Реакція непрямої гемагглютинації (РНДА) Принцип реакції ґрунтується на здатності еритроцитів концентрувати антиген на своїй поверхні і склеюватися, утворюючи видимий осад, при вступі в контакт зі специфічними антитілами. Дана реакція дуже інформативна в діагностиці гострої форми опісторгоспу, гострої і хронічної форми ехінококкозу і тріхінельозу. Іноді РНГА використовується для підтвердження результатів ІФА, що допомагає підвищити достовірність діагностики паразитарних захворювань. Набір, необхідний для проведення реакції, містить: (Д +) еритроцити барана, чутливі до специфічного антигену, (Д-) еритроцити без антигену, (Е) сухі еритроцити барана, (К +) діагностичну агглютинуючу сироватку - позитивний контрольний тест, (К-) нормальна сироватка людини - негативний тест, реагент, що застосовується для підготовки розчину, використовуваного при розведенні сироватки. Постановка реакції відбувається в кілька етапів, строго наступних один за одним. Спочатку готують необхідні розчини, потім готують сироватки та їх контрольні зразки, після чого дані зразки наносяться на планшети. Далі слід нанесення на планшети сенсибілізованих (Д +) і несенсибілізованих (Д-) еритроцитів барана. Дані препарати інкубуються, і через деякий час проводиться облік результатів. Результати проведеної реакції враховуються за чотирибальною системою.

Інтенсивність реакції залежить від кількості обложених еритроцитів на дні освічених лунок: - негативна реакція, яка характеризується осадженням еритроцитів на дно лунок у вигляді невеликого колічка з гладкими краями або «ґудзики» + слабка інтенсивність, для даної реакції характерні невеликі одиночні відкладення на дні лунки. Неагглютіновані еритроцити утворюють «маленьке кілечко» в центрі лунки++ середня інтенсивність, їй властиве утворення на дні лунки «широкого щільного кільця» з неагглютинованих еритроцитів++ + інтенсивна реакція, агглютиновані еритроцити утворюють так звані «парасольки», в центрі яких, явно видно кільця, утворені осілими неагггунірованими. Титром цієї реакції вважають останнє розведення сироватки, при якому виявляється явна агглютинація еритроцитів не менше++ +, тобто при інтенсивній або різко інтенсивній реакції.

Імуноферментний аналіз (ІФА) Принцип методу полягає у своєрідній взаємодії антитіла з антигеном. Однією з обов'язкових умов реакції є попередня фіксація одного з її компонентів, тобто антигену або антитіла, на твердих планшетах. Потім, за допомогою ферментної мітки виявляють виникли комплекси антиген - антитіло завдяки зміні оптичної щільності первісної суміші (субстрату), що проявляється зміною інтенсивності її забарвлення. ІФА властиві деякі переваги перед іншими серологічними методами, наприклад, дана реакція є найбільш чутливою, в тестах використовуються універсальні реагенти, що залишаються стабільними не менше 6 місяців, автоматизований процес обліку результатів реакції. Набір, необхідний для проведення реакції, містить такі компоненти: паразитарний антиген, специфічні сироваткові антитіла, кон'югат, планшета з зафіксованим на ній специфічним паразитарним антигеном, контрольні сироватки. Постановка реакції ІФА відбувається в кілька етапів: спочатку проводиться приготування необхідних розчинів, потім готуються досліджувані зразки сироваток, а також контрольні сироватки, пізніше слідує нанесення приготованих зразків сироватки і контрольних сироваток на твердофазні носії, планшети інкубуються, промиваються і, тільки після проведених процедур в лунки планшет вноситься кон'югат. Через деякий час він видаляється шляхом промивання лунок. На завершальному етапі в лунки вноситься субстратна суміш і витримується в темному місці при кімнатній температурі. Оцінка результатів проводиться автоматично за допомогою спеціальних вимірювальних приладів, в деяких випадках допускається візуальний облік результатів проведеної реакції. Достовірність і якість методів серологічної діагностики залежать від організації проведеного внутрішнього і зовнішнього лабораторного контролю, що складаються з декількох незалежних процедур, призначених для оцінки якості результатів проведеного аналізу.